Fluorescentni filter je bitna komponenta u fluorescentnom mikroskopu. Tipičan sistem ima tri osnovna filtera: ekscitacioni filter, emisioni filter i dikroično ogledalo. Obično se pakuju u kocku tako da se grupa ubacuje zajedno u mikroskop.
Kako funkcioniše fluorescentni filter?
Ekscitacioni filter
Ekscitacioni filteri emituju svetlost određene talasne dužine i blokiraju druge talasne dužine. Mogu se koristiti za proizvodnju različitih boja podešavanjem filtera tako da prođe samo jedna boja. Filteri pobude dolaze u dva glavna tipa — dugopropusni filteri i filteri pojasnog prolaza. Pobuđivač je obično propusni filter koji propušta samo talasne dužine koje apsorbuje fluorofor, čime se minimizira ekscitacija drugih izvora fluorescencije i blokira ekscitaciono svetlo u opsegu emisije fluorescencije. Kao što je prikazano plavom linijom na slici, BP je 460-495, što znači da može proći samo kroz fluorescenciju od 460-495 nm.
Postavljen je unutar putanje osvjetljenja fluorescentnog mikroskopa i filtrira sve talasne dužine izvora svjetlosti osim raspona ekscitacije fluorofora. Minimalni prijenos filtera diktira svjetlinu i sjaj slike. Preporučuje se najmanje 40% prijenosa za bilo koji filter uzbude, tako da je prijenos idealno >85%. Širina pojasa ekscitacionog filtera treba da bude u potpunosti unutar opsega pobuđivanja fluorofora tako da centralna talasna dužina (CWL) filtera bude što je moguće bliža vršnoj talasnoj dužini pobuđivanja fluorofora. Optička gustina ekscitacionog filtera (OD) diktira tamu pozadinske slike; OD je mjera koliko dobro filter blokira talasne dužine izvan opsega prenosa ili propusnog opsega. Preporučuje se minimalni OD od 3,0, ali je idealan OD od 6,0 ili veći.
Emisioni filter
Emisioni filteri služe u svrhu omogućavanja željene fluorescencije iz uzorka da stigne do detektora. Blokiraju kraće talasne dužine i imaju visoku transmisiju za duže talasne dužine. Tip filtera je takođe povezan sa brojem, npr. BA510IF na slici (filter s barijerom interferencije), ta oznaka se odnosi na talasnu dužinu na 50% njegovog maksimalnog prenosa.
Iste preporuke za filtere pobude vrijede i za emisione filtere: minimalni prijenos, širina pojasa, OD i CWL. Emisioni filter s idealnom kombinacijom CWL, minimalnog prijenosa i OD pruža najsvjetlije moguće slike, sa najdubljim mogućim blokiranjem i osigurava detekciju najslabijih signala emisije.
Dikroično ogledalo
Dikroično ogledalo je postavljeno između ekscitacionog filtera i emisionog filtera pod uglom od 45° i reflektuje pobudni signal prema fluoroforu dok emituje signal emisije prema detektoru. Idealni dihroični filteri i razdjelnici zraka imaju oštre prijelaze između maksimalne refleksije i maksimalnog prijenosa, sa >95% refleksije za propusni opseg filtera pobude i prijenosom od >90% za propusni opseg emisionog filtera. Izaberite filter imajući na umu talasnu dužinu preseka (λ) fluorofora, kako biste minimizirali rasuto svetlo i maksimizirali odnos signala i šuma fluorescentne slike.
Dihroično ogledalo na ovoj slici je DM505, nazvano tako jer je 505 nanometara talasna dužina na 50% maksimalnog prenosa za ovo ogledalo. Kriva transmisije za ovo ogledalo pokazuje visoku transmisiju iznad 505 nm, strm pad transmisije lijevo od 505 nanometara i maksimalnu refleksivnost lijevo od 505 nanometara, ali ipak može imati neki prijenos ispod 505 nm.
Koja je razlika između dugopropusnih i pojasnih filtera?
Fluorescencijski filteri se mogu podijeliti u dva tipa: long pass (LP) i band pass (BP).
Dugopropusni filteri prenose duge talasne dužine i blokiraju one kraće. Talasna dužina isključenja je vrijednost na 50% vršne transmisije, a sve valne dužine iznad uključene se prenose pomoću dugopropusnih filtera. Često se koriste u dikroičnim ogledalima i emisionim filterima. Longpass filtere treba koristiti kada aplikacija zahtijeva maksimalno prikupljanje emisije i kada spektralna diskriminacija nije poželjna ili neophodna, što je općenito slučaj za sonde koje stvaraju jednu vrstu emitiranja u uzorcima s relativno niskim nivoom pozadinske autofluorescencije.
Pojasni filteri prenose samo određeni opseg talasne dužine, a blokiraju druge. Oni smanjuju preslušavanje dozvoljavajući samo najjači dio emisionog spektra fluorofora da se prenese, smanjuju šum autofluorescencije i na taj način poboljšavaju omjer signala i šuma u uzorcima visoke pozadinske autofluorescencije, što dugopropusni filteri ne mogu ponuditi.
Koliko vrsta setova fluorescentnih filtera BestScope može isporučiti?
Neke uobičajene vrste filtera uključuju plave, zelene i ultraljubičaste filtere. Kao što je prikazano u tabeli.
| Set filtera | Ekscitacioni filter | Dikroično ogledalo | Barrier Filter | LED lampa Wave Length | Aplikacija |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485nm | ·FITC: Fluorescentna metoda antitijela ·Acidin narandžasta: DNK, RNK ·Auramin: bacil tuberkuloze ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | ·Rhodamine, TRITC: Fluorescentna metoda antitijela · Propidijum jodid: DNK ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365nm | · Automatsko posmatranje fluorescencije ·DAPI: DNK bojenje ·Hoechest 332528, 33342: koristi se za bojenje hromozoma |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405nm | ·Kateholamini ·5-hidroksi triptamin ·Tetraciklin: skelet, zubi |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Setovi filtera koji se koriste u akviziciji fluorescencije dizajnirani su oko glavnih valnih dužina koje se koriste u fluorescentnim aplikacijama, koje se zasnivaju na najčešće korištenim fluoroforima. Iz tog razloga su i nazvani po fluoroforu za koji su namijenjeni za snimanje, kao što su DAPI (plava), FITC (zelena) ili TRITC (crvena) filter kocke.
| Set filtera | Ekscitacioni filter | Dikroično ogledalo | Barrier Filter | LED lampa Wave Length |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-Auramine | BP470 | DM480 | BA485 | 450nm |
| Texas Red | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
Kako odabrati fluorescentni filter?
1. Princip odabira fluorescentnog filtera je da fluorescentno/emisiono svjetlo prođe kroz kraj za snimanje što je dalje moguće i da istovremeno potpuno blokira ekscitacijsko svjetlo, kako bi se dobio najveći omjer signal-šum. Posebno za primjenu multifotonske ekscitacije i mikroskopa totalne unutrašnje refleksije, slab šum će također uzrokovati velike smetnje efektu slike, tako da je zahtjev za omjerom signala i šuma veći.
2. Poznavati ekscitacijski i emisioni spektar fluorofora. Da bi se konstruirao set fluorescentnih filtera koji generiše visokokvalitetnu sliku visokog kontrasta sa crnom pozadinom, ekscitacioni i emisioni filteri bi trebali postići visoku transmisiju s minimalnim mreškanjem pojasa propusnosti preko područja koja odgovaraju ekscitacijskim pikovima ili emisijama fluorofora.
3. Razmotrite trajnost fluorescentnih filtera. Ovi filteri moraju biti nepropusni za intenzivne izvore svjetlosti koji stvaraju ultraljubičasto (UV) svjetlo koje bi moglo dovesti do „izgaranja“, posebno filtera uzbuđivača jer je podvrgnut punom intenzitetu izvora osvjetljenja.
Različite fluorescentne slike uzoraka
Resursi se prikupljaju i organiziraju na Internetu i koriste se samo za učenje i komunikaciju. Ako postoji bilo kakvo kršenje, molimo kontaktirajte nas da izbrišemo.
Vrijeme objave: Dec-09-2022